This is an HTML version of an attachment to the Freedom of Information request 'COVID-19 nMABs Access and Policy National Expert Group - Evusheld'.

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.

Resilience of S309 and AZD7442 monoclonal antibody treatments against 

infection by SARS-CoV-2 Omicron lineage strains 

 

James Brett Case1, Samantha Mackin1,2, John Errico2, Zhenlu Chong1, Emily A. Madden1, 

Barbara Guarino3, Michael A. Schmid3, Kim Rosenthal4, Kuishu Ren4, Ana Jung2, Lindsay 

Droit5, Scott A. Handley2, Peter J. Halfmann6, Yoshihiro Kawaoka6,7,8, James E. Crowe, Jr.9,10,11, 

Daved H. Fremont2,5,12, Herbert W. Virgin2,13,14, Yueh-Ming Loo4, Mark T. Esser4, Lisa A. 

Purcell13, Davide Corti3, and Michael S. Diamond1,2,5,15,16† 

 
1
10 
Department of Medicine, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO. 
2
11 
Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine, St. 
12 
Louis, MO. 
3
13 
Humabs BioMed SA, a subsidiary of Vir Biotechnology, Bellinzona, Switzerland. 
4
14 
Vaccines and Immune Therapies, BioPharmaceuticals R&D, AstraZeneca, Gaithersburg, MD. 
5
15 
Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine, St. Louis, 
16 
MO. 
6
17 
Influenza Research Institute, Department of Pathobiological Sciences, School of Veterinary 
18 
Medicine, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI. 
7
19 
Division of Virology, Institute of Medical Science, University of Tokyo, Tokyo, Japan. 
8
20 
The Research Center for Global Viral Diseases, National Center for Global Health and 
21 
Medicine 
22 
Research Institute, Tokyo, Japan. 
9
23 
Vanderbilt Vaccine Center, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN. 
10
24 
Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN. 
11
25 
Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical 
26 
Center, Nashville, TN. 
12
27 
Department of Biochemistry & Molecular Biophysics, Washington University School of 
28 
Medicine, St. Louis, MO. 
 


https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
13
29 
Vir Biotechnology, San Francisco, CA. 
14
30 
University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX. 
15
31 
Andrew M. and Jane M. Bursky Center for Human Immunology and Immunotherapy 
32 
Programs, Washington University School of Medicine, Saint Louis, MO. 
16
33 
Center for Vaccines and Immunity to Microbial Pathogens, Washington University School of 
34 
Medicine, Saint Louis, MO. 
35 
 
36 
† Corresponding author: 
 
 
 


https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
37 
ABSTRACT 
38 
Omicron variant strains encode large numbers of changes in the spike protein 
39 
compared to historical SARS-CoV-2 isolates. Although in vitro studies have suggested that 
several monoclonal antibody therapies lose neutralizing activity against Omicron variants1-
40 
4
41 
, the effects in vivo remain largely unknown. Here, we report on the protective efficacy 
42 
against three SARS-CoV-2 Omicron lineage strains (BA.1, BA.1.1, and BA.2) of two 
43 
monoclonal antibody therapeutics (S309 [Vir Biotechnology] monotherapy and AZD7442 
44 
[AstraZeneca] combination), which correspond to ones used to treat or prevent SARS-
45 
CoV-2 infections in humans. Despite losses in neutralization potency in cell culture, S309 or 
46 
AZD7442 treatments reduced BA.1, BA.1.1, and BA.2 lung infection in susceptible mice 
47 
that express human ACE2 (K18-hACE2). Correlation analyses between in vitro 
48 
neutralizing activity and reductions in viral burden in K18-hACE2 or human Fcγ
49 
transgenic mice suggest that S309 and AZD7442 have different mechanisms of protection 
50 
against Omicron variants, with S309 utilizing Fc effector function interactions and 
51 
AZD7442 acting principally by direct neutralization. Our data in mice demonstrate the 
52 
resilience of S309 and AZD7442 mAbs against emerging SARS-CoV-2 variant strains and 
53 
provide insight into the relationship between loss of antibody neutralization potency and 
54 
retained protection in vivo
55 
 
 
 


https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
56 
MAIN TEXT 
57 
Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) variant strains continue 
58 
to emerge and spread globally despite currently employed countermeasures and public health 
59 
mandates. Since late 2020, variants of concern (VOC) and interest (VOI) have arisen due to 
60 
continued SARS-CoV-2 evolution. Many variants contain substitutions in the N-terminal domain 
61 
(NTD) and the receptor binding motif (RBM) of the receptor binding domain (RBD). Omicron 
62 
lineage variants containing the largest numbers of spike protein changes described so far have 
63 
emerged, spread globally, and become dominant. Moreover, cell-based studies suggest that the 
64 
neutralizing activity of many monoclonal antibodies (mAbs) with Emergency Use Authorization 
65 
(EUA) status or in advanced clinical development is diminished or abolished against Omicron 
66 
lineage strains (BA.1, BA.1.1, and BA.2)1,2,5,6. However, the effect of mutations that compromise 
67 
antibody neutralization on their efficacy in vivo against SARS-CoV-2 remains less clear. Indeed, 
68 
for some classes of broadly neutralizing mAbs against influenza7,8 and Ebola9,10 viruses, there is 
69 
no strict correlation between neutralizing activity in vitro and protection in animal models. Here, 
70 
using mAbs that are currently in use to prevent or treat SARS-CoV-2 infection, we evaluated 
71 
how the antigenic shift in Omicron variants affects neutralization in cells and protection in mice. 
72 
 
73 
MAb neutralization against Omicron lineage viruses 
74 
 
We analyzed the substitutions in the RBDs of BA.1 (B.1.1.529), BA.1.1 (B.1.1.529 
75 
R346K), and BA.2 strains (Fig. 1a, Extended Data Fig. 1) in the context of the structurally-
76 
defined binding epitopes of S309, a cross-reactive SARS-CoV mAb and the parent of 
77 
Sotrovimab [VIR-7831], and AZD8895 and AZD1061, two mAbs that together (AZD7442) form 
78 
the clinically-used Evusheld combination treatment (Fig. 1b-e, Extended Data Fig. 1). S309 
 


https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
79 
binds a conserved epitope on the RBD that is spatially distinct from the RBM11 and the 
80 
AZD8895 and AZD1061 antibodies bind non-overlapping RBM epitopes12. Across Omicron 
81 
lineage strains, substitutions at several antibody contact residues have occurred (S309: G339D, 
82 
R346K, N440K; AZD8895: K417N, S477N, T478K, E484A, Q493R; AZD1061: R346K, 
83 
N440K, E484A, Q493R).  
84 
 
Because of these sequence changes, we assessed the neutralizing activity of S309, 
85 
AZD8895, AZD1061, and AZD7442 against BA.1, BA.1.1, and BA.2 viruses in Vero-
86 
TMPRSS2 cells. For these studies, we used mAbs that correspond to the products in clinical use 
87 
which have Fc modifications: S309-LS [M428L/N434S], AZD8895-YTE/TM 
88 
[M252Y/S254T/T256E and L234F/L235E/P331S], AZD1061-YTE/TM, and AZD7442-
89 
YTE/TM. The LS and YTE Fc substitutions result in extended antibody half-life in humans, and 
90 
the TM changes reduce Fc effector functions13. Compared to the historical WA1/2020 D614G 
91 
strain (hereafter D614G), antibody incubation with BA.1 was associated with 2.5-fold (S309-
92 
LS), 25-fold (AZD7442-YTE/TM), 118-fold (AZD8895-YTE/TM), and 206-fold (AZD1061-
93 
YTE/TM) reductions in neutralization potency (Fig. 1f-o), which agree with experiments with 
94 
authentic or pseudotyped SARS-CoV-21,2,5,6. Some differences were observed with BA.1.1: 
95 
whereas S309-LS and AZD8895-YTE/TM were only slightly less effective against BA.1.1 
96 
compared to BA.1, the neutralizing activity of AZD1061-YTE/TM was reduced by almost 
97 
1,700-fold. Despite the decrease in activity of the AZD1061-YTE/TM component, the 
98 
AZD7442-YTE/TM combination still showed inhibitory activity against BA.1.1 with a 176-fold 
99 
reduction compared to D614G. Whereas small (no change to 5-fold) reductions in neutralization 
100 
activity were observed with AZD1061-YTE/TM and AZD7442-YTE/TM against BA.2, larger 
101 
reductions (32- and 68-fold) were observed for S309-LS and AZD8895-YTE/TM compared to 
 


https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
102 
D614G. Overall, these data demonstrate that S309 retains potency against BA.1 and BA.1.1 
103 
strains but has less in vitro neutralizing activity against BA.2, and the AZD7442 combination 
104 
shows reduced yet residual activity against strains from all three Omicron lineages. 
105 
 
106 
MAb protection in vivo against Omicron viruses 
107 
Because S309 and AZD7442 mAbs might act in vivo by a combination of mechanisms 
108 
that are not fully reflected by in vitro neutralization potency assays, we evaluated the effects of 
109 
the mutations observed in BA.1, BA.1.1 and BA.2 on efficacy in animals. For these studies, we 
110 
used S309-LS and a different form of AZD7442, which contained only the TM substitutions and 
111 
not the YTE modification.  Although the YTE modification promotes antibody recycling to 
112 
confer extended antibody half-life in humans and non-human primates, it accelerates antibody 
113 
elimination in rodents14. To assess the efficacy of S309-LS and AZD7442-TM in vivo, we 
114 
administered a single 200 μg (~10 mg/kg total) mAb dose to K18-hACE2 transgenic mice by 
115 
intraperitoneal injection one day prior to intranasal inoculation with BA.1, BA.1.1, or BA.2 
116 
strains. Although Omicron lineage viruses are less pathogenic in mice, they still replicate to high 
117 
levels in the lungs of K18-hACE2 mice15. Nonetheless, as preliminary studies suggested slightly 
118 
different kinetics of replication and spread in mice, we harvested samples at 7 dpi for BA.1 and 
119 
BA.1.1 and 6 dpi for BA.216. In BA.1 and BA.1.1-infected mice, S309-LS mAb reduced viral 
120 
burden in the lung, nasal turbinates, and nasal washes at 7 dpi compared to isotype mAb-control 
121 
treated mice (Fig. 2a-d). Nonetheless, control of infection, as judged by viral RNA levels, was 
122 
less efficient against BA.1 (182-fold reduction) and BA.1.1 (39-fold reduction) viruses than 
123 
against D614G (>500,000-fold reduction). Despite the diminished neutralizing activity against 
124 
BA.2 in vitro, S309-LS treatment reduced viral RNA levels in the lungs of BA.2-infected mice 
 


https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
125 
substantially (742-fold reduction) (Fig 2a, b). Protection by S309-LS was not observed in the 
126 
nasal turbinates or nasal washes of mice challenged with BA.2 (Fig. 2c, d), in part due to the low 
127 
and variable levels of infection with this variant. AZD7442-TM treatment differentially reduced 
128 
viral burden in the lungs of mice against D614G (>400,000-fold reduction in viral RNA), BA.1 
129 
(91-fold reduction in viral RNA), BA.1.1 (4-fold reduction in viral RNA), and BA.2 (>100,000-
130 
fold reduction in viral RNA) (Fig. 2e, f). Protection in the upper respiratory tract was less 
131 
consistent, as AZD7442-TM treatment lowered viral RNA levels in the nasal washes of D614G 
132 
and BA.1-infected mice but not in BA.1.1 or BA.2-infected mice and failed to reduce D614G, 
133 
BA.1, BA.1.1, or BA.2 infection in the nasal turbinates (Fig. 2g, h). 
134 
As an independent metric of mAb protection, we measured cytokine and chemokine 
135 
levels in the lung homogenates of S309-LS and AZD7442-TM treated animals infected with 
136 
Omicron variant strains (Fig 2i-j, and Extended Data Fig. 2, 3). All infected K18-hACE2 mice 
137 
receiving isotype control mAbs had increased expression levels of several pro-inflammatory 
138 
cytokines and chemokines such as G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-6, CXCL-10, CCL-2, and 
139 
CCL-4 when compared to uninfected mice. In contrast, mice treated with AZD7442-TM mAbs 
140 
and infected with BA.1 or BA.2 but not BA.1.1. showed reduced levels of pro-inflammatory 
141 
cytokines and chemokines, which is consistent with effects on viral burden (Fig. 2e, f). In 
142 
comparison to the isotype controls, mice treated with S309-LS had lower levels of cytokines and 
143 
chemokines in lung homogenates after infection with all three Omicron variants, although the 
144 
protection against BA.2-induced inflammation was less than against BA.1. or BA.1.1. Overall, 
145 
these experiments suggest that despite losses in neutralizing potency in cell culture, S309-LS or 
146 
AZD7442-TM can limit inflammation in the lung caused by Omicron variants. 
 


https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
147 
 
We next evaluated whether the differences in neutralizing activity of S309-LS and 
148 
AZD7442-YTE/TM correlated with lung viral burden after infection with the three Omicron 
149 
strains. The change in AZD7442-YTE/TM neutralizing activity associated directly with the 
150 
differences in lung viral burden of each Omicron variant (Fig. 2k). This relationship is consistent 
151 
with its likely mechanism of action, virus neutralization and inhibition of entry17,18. The 
152 
AZD7442-TM version we used, like the clinical drug Evusheld, encodes for modifications in the 
153 
constant region of the mAb heavy chains that profoundly decrease binding to Fc-gamma 
154 
receptors (FcγRs) and complement components (19 and Fig 3a). In comparison, for S309-LS, a 
155 
similar direct correlation between changes in neutralization potency in vitro and reductions in 
156 
viral burden in vivo was not observed (Fig. 2l), indicating a possible additional protective 
157 
mechanism beyond virus neutralization.  
158 
 
159 
S309-LS employs Fc effector functions to protect against SARS-CoV-2 variants 
160 
To evaluate a potential role for Fc effector functions in S309 mAb-mediated protection 
161 
against Omicron strains, we engineered loss-of-function GRLR mutations (G236R, L328R) into 
162 
the Fc domain of the human IgG1 heavy chain of S309; these substitutions eliminate antibody 
163 
binding to FcγRs13. Introduction of the GRLR mutations abrogated binding to hFcγRI and 
164 
hFcγRIIIa, as expected (Fig. 3a) but did not affect neutralization of the SARS-CoV-2 strains 
165 
(Extended Data Fig. 4). Next, we compared VIR-7831 (the clinical form of S309-LS) and 
166 
S309-GRLR in an in vitro antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC) assay. When target cells 
167 
expressing similar levels of Wuhan-D614, BA.1, or BA.2 spike proteins on the cell surface (Fig. 
168 
3b) were incubated with VIR-7831 mAb, we observed some reductions in binding to Omicron 
169 
spike proteins compared to mAb S2X324, an antibody that retains neutralizing activity against 
 


https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
170 
BA.1, BA.1.1, and BA.2 and engages a distinct epitope in the RBM4. Despite the differences in 
171 
binding, target cells expressing Wuhan-D614, BA.1, or BA.2 spike proteins were lysed 
172 
efficiently by primary natural killer (NK) cells (antibody-dependent cellular cytotoxicity, 
173 
ADCC) isolated from four donors by VIR-7831 but not by S309-GRLR (Fig. 3c, d, Extended 
174 
Data Fig. 5). Similarly, primary CD14+  monocytes isolated from five donors mediated 
175 
comparable antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) of target cells expressing Wuhan-
176 
D614, BA.1, or BA.2 spike proteins by VIR-7831 but not by S309-GRLR (Fig. 3e, f, Extended 
177 
Data Fig. 6, 7). 
178 
To evaluate the role of effector functions in vivo in S309-LS mAb-mediated protection 
179 
against Omicron variant strains, we treated K18-hACE2 mice with a single 200 μg (~10 mg/kg 
180 
total) dose of S309-GRLR mAb by intraperitoneal injection one day prior to intranasal 
181 
inoculation with D614G, BA.1, or BA.2 strains. At 6 (BA.2) or 7 (D614G and BA.1) dpi, viral 
182 
RNA levels in the lungs, nasal turbinates, and nasal washes were measured (Fig. 3g-i). Although 
183 
S309-GRLR treatment reduced viral burden in the lung and nasal turbinates of D614G-infected 
184 
mice, it did not limit infection by BA.1 and BA.2 strains in the tissues tested. To corroborate 
185 
these findings, we treated human FcγR (hFcγR) transgenic C57BL/6 mice20 with a single 3 
186 
mg/kg dose of S309-LS or S309-GRLR mAbs one day prior to inoculation with a SARS-CoV-2 
187 
Beta (B.1.351) isolate; we used the Beta isolate for these studies because Omicron strains 
188 
replicate poorly in conventional C57BL/6 mice lacking expression of hACE216. At 2 or 4 dpi, 
189 
S309-LS mAb-treated hFcγR mice showed markedly reduced levels of viral RNA (49 to 127-
190 
fold) or infectious virus (56- to 538-fold) in the lung compared to the isotype control-treated 
191 
mice, whereas animals administered S309-GRLR showed smaller (2.3- to 13-fold) differences, 
192 
most of which did not attain statistical significance (Fig. 3j, k).  Collectively, these data suggest 
 


https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
193 
that the protection mediated by S309-LS mAb in vivo is mediated at least in part by Fc effector 
194 
functions and engagement of FcγRs. 
195 
DISCUSSION 
196 
Due to the continued emergence of SARS-CoV-2 variants encoding an increasing 
197 
number of amino acid changes in the spike protein, antibody countermeasure efficacy requires 
198 
continued monitoring. When the BA.1 Omicron virus emerged in late 2021, five mAb therapies 
199 
were in late-stage clinical development or had acquired EUA status. In vitro assays with 
200 
pseudoviruses5 and authentic viruses1 established that mAb therapies from Regeneron 
201 
(REGN10933 and REGN10987), Lilly (LY-CoV555 and LY-CoV016), and Celltrion (CT-P59) 
202 
showed a complete loss in neutralizing activity against BA.1. Subsequent experiments in K18-
203 
hACE2 mice confirmed that the REGN-COV2 mAb cocktail completely lost its efficacy against 
204 
the BA.1 variant21. More recently, an additional antibody (LY-CoV1404, bebtelovimab), which 
205 
shows considerable neutralization activity against a range of SARS-CoV-2 strains, received EUA 
206 
status22, although protection data in vivo against VOC, including Omicron, has not yet been 
207 
published.  
208 
 We compared the in vitro neutralizing activity and in vivo efficacy of S309 (parent mAb 
209 
of Sotrovimab) and AZD7442 (Evusheld) that correspond to the clinically-used products. Our 
210 
study establishes the utility of S309 and AZD7442 mAbs against highly divergent SARS-CoV-2 
211 
variants. Despite losses in neutralization potency against BA.1, BA.1.1, and BA.2 strains, S309-
212 
LS and AZD7442-TM reduced viral burden and pro-inflammatory cytokine levels in the lungs of 
213 
K18-hACE2 mice, albeit with some differences in activity and mechanisms of action. Although 
214 
AZD7442-TM had a limited protective effect on viral burden in the nasal washes and nasal 
215 
turbinates of infected mice, this was not entirely unexpected, as studies with the parental mAbs 
 
10

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
216 
COV2-2196 and COV2-2130 showed less protection in nasal washes than lungs against multiple 
217 
SARS-CoV-2 VOC23. Moreover, studies in non-human primates with anti-SARS-CoV-2 human 
218 
mAbs showed the concentrations in nasopharyngeal washes are approximately 0.1% of those 
219 
found in the serum24, which likely explains their diminished benefit in this tissue compartment.  
220 
We also assessed whether the reductions in mAb neutralization potency against Omicron 
221 
variant strains correlated with the observed changes in viral burden. For AZD7442-TM, which 
222 
contains L234F/L235E/P331S modifications that abolish Fc receptor engagement13 and were 
223 
introduced to decrease the potential risk of antibody-dependent enhancement of disease18, 
224 
antibody-mediated reductions in viral titer corresponded directly with neutralization activity 
225 
against Omicron variant strains; thus, neutralization is likely a key protective mechanism for 
226 
these RBM-specific mAbs. For S309-LS, which only contains half-life extending M428L/N434S 
227 
modifications in the human IgG1 Fc domain, and exhibits Fc effector functions including ADCC 
228 
and ADCP11, changes in neutralization potency did not linearly relate to changes in lung viral 
229 
titer. S309-LS mAb treatment still conferred significant protection in the lungs of mice infected 
230 
with BA.2 despite a substantial loss in neutralizing activity. Because of these results, we 
231 
evaluated the contributions of Fc effector functions in protection in mice using S309-GRLR, 
232 
which has G236R/L328R mutations in the Fc domain that abrogate binding to FcγRs13. We 
233 
observed that intact S309-LS but not S309-GRLR mAb protected K18-hACE2 and hFcγR mice 
234 
against SARS-CoV-2 variant strains. These results are consistent with prior studies showing a 
beneficial role of Fc-effector functions in antibody mediated protection in mice and hamsters25-
235 
29
236 
, and may explain why mAbs with markedly different in vitro neutralization potencies against 
237 
SARS-CoV-2 strains show similar protective activity in animals 
238 
(https://opendata.ncats.nih.gov/covid19/animal). Furthermore, they also demonstrate that for 
 
11

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
239 
some mAbs, Fc effector functions can compensate for losses in neutralization potency against 
240 
SARS-CoV-2 variants and act as a protective mechanism in vivo. Thus, effector functions can 
241 
contribute to resilience of some mAbs against Omicron and other VOC30,31. We speculate that 
242 
the stoichiometric threshold and antibody occupancy requirements for Fc effector function 
243 
activity may be lower than for virion neutralization32; if so, this property might clarify how 
244 
antibodies with reduced neutralizing potency against VOC that still bind spike protein on the 
245 
virion or surface of infected cells retain protective activity in vivo. 
246 
Limitations of study. We note several limitations of our study: (a) Female K18-hACE2 
247 
mice were used to allow for group caging. Follow-up experiments in male mice to confirm and 
248 
extend these results are needed. (b) The BA.1, BA.1.1., and BA.2 viruses are less pathogenic in 
249 
mice than the D614G virus16,33-35. This could lead to an overestimation of protection compared to 
250 
other more virulent strains in mice. (c) We only evaluated the efficacy of S309 or AZD7442 as 
251 
prophylaxis. Whereas AZD7442 is authorized only as preventive agent, post-exposure 
252 
therapeutic studies with both mAbs and Omicron variants may provide further insight as to 
253 
effects on potency.  Moreover, the relationship between initial viral dosing and antibody 
254 
protection against Omicron variants was not explored. (d) Several experiments were performed 
255 
in transgenic mice that over-express human ACE2 receptors. High levels of cellular hACE2 can 
256 
diminish the neutralizing activity of mAbs that bind non-RBM sites of the SARS-CoV-2 
257 
spike36,37. Thus, studies in hACE2-transgenic mice could underestimate the efficacy of mAbs 
258 
binding outside of the RBM. Challenge studies in other animal models and ultimately humans 
259 
will be required for corroboration, including the contribution of Fc effector functions to mAb 
260 
efficacy.  
 
12

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
261 
Collectively, our data expand on recent in vitro findings with BA.1 strains by evaluating 
262 
the level of protection conferred by treatment with two EUA mAbs against the three currently 
263 
dominant Omicron variants. While S309-LS (and by extension Sotrovimab) and AZD7442-TM 
264 
(Evusheld) retained inhibitory activity against several Omicron lineage strains, the impact of 
265 
shifts in neutralization potency in vitro may not directly predict dosing in the clinical setting. 
266 
Finally, our studies highlight the potential of both mAb neutralization and Fc effector function 
267 
mechanisms in protecting against SARS-CoV-2-mediated disease and suggest mechanisms of 
268 
action for withstanding mutations in variant strains that reduce but do not abrogate mAb binding 
269 
and neutralization.  
270 
 
271 
 
 
 
13

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
272 
ACKNOWLEDGEMENTS 
273 
This study was supported by grants and contracts from the NIH (R01 AI157155, U01 
274 
AI151810, NIAID Centers of Excellence for Influenza Research and Response (CEIRR) contract 
275 
75N93019C00051) and the Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA; HR0011-
276 
18-2-0001).  J.B.C. is supported by a Helen Hay Whitney Foundation postdoctoral fellowship. 
277 
E.A.M. is supported by a W.M. Keck postdoctoral fellowship from Washington University. We 
278 
thank 
 and 
 for technical support. 
279 
 
280 
AUTHOR CONTRIBUTIONS 
281 
 
 J.B.C. performed and analyzed neutralization assays. J.M.E. performed structural analyses 
282 
with guidance from D.H.F. J.B.C., S.M., Z.C., and E.A.M. performed mouse experiments and 
283 
viral burden analyses. J.B.C. propagated and validated SARS-CoV-2 viruses. B.G. and M.A.S. 
284 
designed, performed, and analyzed in vitro Fc-mediated effector function studies. K. Rosenthal, 
285 
and K. Ren performed antibody analyses. A.J., L.D., and S.A.H. performed deep sequencing 
286 
analysis. L.A.P., D.C., Y-M.L., and M.T.E.  provided mAbs. P.J.H. and Y.K. provided SARS-
287 
CoV-2 strains. J.E.C. and H.W.V. provided key intellectual contributions to the design of the 
288 
study D.H.F. and M.S.D. obtained funding and supervised the research. J.B.C. and M.S.D. wrote 
289 
the initial draft, with the other authors providing editorial comments.  
290 
 
291 
COMPETING FINANCIAL INTERESTS 
292 
 
M.S.D. is a consultant for Inbios, Vir Biotechnology, Senda Biosciences, and Carnival 
293 
Corporation, and on the Scientific Advisory Boards of Moderna and Immunome. The Diamond 
294 
laboratory has received funding support in sponsored research agreements from Moderna, Vir 
 
14

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
295 
Biotechnology, and Emergent BioSolutions. J.E.C. has served as a consultant for Luna 
296 
Innovations, Merck, and GlaxoSmithKline, is a member of the Scientific Advisory Board of 
297 
Meissa Vaccines and is founder of IDBiologics. The Crowe laboratory has received sponsored 
298 
research agreements from AstraZeneca, Takeda, and IDBiologics during the conduct of the 
299 
study. Vanderbilt University has applied for patents for some of the antibodies in this paper, for 
300 
which J.E.C. is an inventor. B.G., M.A.S, H.W.V., D.C., and L.A.P. are employees of Vir 
301 
Biotechnology and may hold equity in Vir Biotechnology. L.A.P. is a former employee and may 
302 
hold equity in Regeneron Pharmaceuticals. H.W.V. is a founder and holds shares in PierianDx 
303 
and Casma Therapeutics. Neither company provided resources to this study. Y.K. has received 
304 
unrelated funding support from Daiichi Sankyo Pharmaceutical, Toyama Chemical, Tauns 
305 
Laboratories, Inc., Shionogi & Co. LTD, Otsuka Pharmaceutical, KM Biologics, Kyoritsu 
306 
Seiyaku, Shinya Corporation, and Fuji Rebio. K. Rosenthal, K. Ren, Y-M.L. and M.T.E. are 
307 
employees of AstraZeneca and may hold stock in AstraZeneca. All other authors declare no 
308 
competing financial interests. 
309 
 
310 
 
 
 
15

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
311 
FIGURE LEGENDS 
312 
Figure 1. Neutralization of Omicron lineage strains by mAbs. a, One protomer of the 
313 
SARS-CoV-2 spike trimer (PDB: 7C2L) is depicted with BA.2 variant amino acid substitutions 
314 
labelled and shown as red spheres. The N-terminal domain (NTD), RBD, RBM, and S2 are 
315 
colored in yellow, green, magenta, and blue, respectively. All mutated residues in the BA.2 RBD 
316 
relative to WA1/2020 are indicated in b, and the BA.2 RBD bound by mAbs S309 (orange, 
317 
PDB: 6WPS) (b), AZD8895 (green, PDB: 7L7D) (c), and AZD1061 (purple, PDB:7L7E) (d) are 
318 
shown. BA.2 mutations in the respective epitopes of each mAb are shaded red, whereas those 
319 
outside the epitope are shaded green. e, Multiple sequence alignment showing the epitope 
320 
footprints of each mAb on the SARS-CoV-2 RBD (orange, S309; green, AZD8895; purple, 
321 
AZD1061). The WA1/2020 RBD is shown in the last row with relative variant sequence changes 
322 
indicated. Red circles below the sequence alignment indicate hACE2 contact residues on the 
323 
SARS-CoV-2 RBD38. Structural analysis and depictions were generated using UCSF 
324 
ChimeraX39. f-i, Neutralization curves in Vero-TMPRSS2 cells with the indicated SARS-CoV-2 
325 
strain and mAb. The average of three to four experiments performed in technical duplicate are 
326 
shown.  j-m, Comparison of EC50 values for the indicated mAb against D614G, BA.1, BA.1.1, 
327 
and BA.2 viruses. Data are the average of three experiments, error bars indicate standard error of 
328 
the mean (SEM), and the dashed line indicates the upper limit of detection (one-way ANOVA 
329 
with Dunnett’s test; ns, not significant, * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 
330 
0.0001). n, Summary of the EC50 values for each mAb against the indicated SARS-CoV-2 strain. 
331 
o, Summary of the fold-change in EC50 values for each mAb against the indicated Omicron strain 
332 
relative to SARS-CoV-2 D614G. 
 
16

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
333 
Figure 2. Antibody protection against Omicron variants in K18-hACE2 mice.  a-j
334 
Eight-week-old female K18-hACE2 mice received 200 μg (about 10 mg/kg) of the indicated 
335 
mAb treatment by intraperitoneal injection one day before intranasal inoculation with 103 FFU of 
336 
the indicated SARS-CoV-2 strain. Tissues were collected at six (BA.2) or seven days (all other 
337 
strains) after inoculation. Viral RNA levels in the lungs (a, e)nasal turbinates (cg), and nasal 
338 
washes (d, h) were determined by RT-qPCR, and infectious virus in the lungs (b, f) was assayed 
339 
by plaque assay (lines indicate median ± SEM.; n = 6-8 mice per group, two experiments; Mann-
340 
Whitney test between isotype and mAb treatment; ns, not significant; * P < 0.05, ** P < 0.01, 
341 
***,  P < 0.001). i-j, Heat map of cytokine and chemokine protein expression levels in lung 
342 
homogenates from the indicated groups. Data are presented as log2-transformed fold-change over 
343 
naive mice. Blue, reduction; red, increase. k-l, Correlation analysis. The fold-change in EC50 
344 
value of AZD7442-YTE/TM (k) and S309-LS (l) for D614G and each Omicron variant strain are 
345 
plotted on the x-axis. The fold-change in lung viral RNA titer between the respective isotype or 
346 
mAb-treated groups against each Omicron variant strain are plotted on the y-axis. Best-fit lines 
347 
were calculated using a simple linear regression. Two-tailed Pearson correlation was used to 
348 
calculate the R2 and P values indicated within each panel. 
349 
Figure 3. Role of Fc-effector functions in S309 mAb-mediated protection. a, Binding 
350 
of AZD7442-TM, S309-LS, or S309-GRLR mAbs to hFcγRI or hFcγRIIIa (two experiments; 
351 
dotted lines indicate the limit of detection). b, ExpiCHO-S cells were transiently transfected with 
352 
plasmids encoding the indicated SARS-CoV-2  spike protein. 24 to 48 h later, cells were 
353 
harvested, washed, and stained with the indicated concentrations of VIR-7831 or S2X324 mAbs 
354 
to assess binding to the cell surface. Representative histograms from two-three experiments are 
355 
shown.  c, ExpiCHO-S cells transiently transfected with Wuhan-1 D614, BA.1, or BA.2 spike 
 
17

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
356 
proteins were incubated with the indicated concentrations of VIR-7831 or S309-GRLR mAb and 
357 
mixed with purified NK cells isolated from healthy donors at a ratio of 1:9 (target:effector). Cell 
358 
lysis was determined by a lactate dehydrogenase release assay. The error bars indicate standard 
359 
deviations (SD). d, Area under the curve (AUC) analyses from four NK donors (Extended Data 
360 
Fig. 5).  e, ExpiCHO-S cells transiently transfected with Wuhan-1 D614, BA.1, or BA.2 spike 
361 
proteins and fluorescently labelled with PKH67 were incubated with the indicated concentrations 
362 
of VIR-7831 or S309-GRLR mAb and mixed with PBMCs labelled with CellTrace Violet from 
363 
healthy donors at a ratio of 1:20 (target:PBMCs). Association of CD14+ monocytes with spike-
364 
expressing target cells (ADCP) was determined by flow cytometry. The error bars indicate SD. f
365 
AUC analyses of VIR-7831 and S309-GRLR for each Omicron variant for four donors. (g-i
366 
Eight-week-old female K18-hACE2 mice or (j-k) 12-week-old male hFcγR mice received a 
367 
single 10 
mg/kg or 3 mg/kg dose respectively, of S309-LS or S309-GRLR mAb by 
368 
intraperitoneal injection one day before intranasal inoculation with 103 FFU of D614G, BA.1, or 
369 
BA.2 (g-i) or 105 FFU of Beta (B.1.351) (j-k). Tissues were collected at 2 (B.1.351), 4 (B.1.351), 
370 
6 (BA.2), or 7 (D614G and BA.1) dpi. Viral RNA levels in the lungs (g, j-k),  nasal turbinates 
371 
(h), and nasal washes (i) were determined by RT-qPCR, and infectious virus in the lungs (j-k
372 
was measured by plaque assay (g-k; lines indicate median ± SEM.; g-i  and  j-k;  n = 8  and 
373 
10 mice per group, respectively; two experiments; g-i; (Mann-Whitney test between isotype and 
374 
mAb treatment; ns, not significant; ** P < 0.01, ***, P < 0.001); j-k; one-way ANOVA with 
375 
Tukey’s multiple comparisons test; ns, not significant; * P < 0.05, ** P < 0.01, ***, P < 0.001, 
376 
****, P < 0.0001). 
377 
 
378 
EXTENDED DATA FIGURES 
 
18

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
379 
 
Extended Data Figure 1. BA.1.1 spike protein substitutions and mAb epitopes. 
380 
Mutated residues in the BA.1.1 RBD relative to WA1/2020 are indicated in green in all three 
381 
panels. The BA.1.1 RBD bound by mAbs S309 (orange, PDB: 6WPS) (a), AZD8895 (pale 
382 
green, PDB: 7L7D) (b), and AZD1061 (purple, PDB:7L7E) (c) are shown. BA.1.1 substitutions 
383 
in the respective epitopes of each mAb are shaded red, whereas those outside the epitope are 
384 
shaded green. Structural analysis and depictions were generated using UCSF ChimeraX39. 
385 
 
Extended Data Figure 2. Cytokine and chemokine induction after S309-LS 
386 
treatment and SARS-CoV-2 infection. Individual graphs of cytokine and chemokine protein 
387 
levels in the lungs of S309-LS mAb-treated K18-hACE2 mice at 6 (BA.2) or 7 dpi (all other 
388 
strains) with the indicated SARS-CoV-2 strain (line indicates median; n = 3 naive, n = 6-8 for all 
389 
other groups (Mann-Whitney test with comparison between the isotype control and mAb: *, P < 
390 
0.05, **, P < 0.01, ***, P < 0.001).  
391 
Extended Data Figure 3. Cytokine and chemokine induction after AZD7442-TM 
392 
treatment and SARS-CoV-2 infection. Individual graphs of cytokine and chemokine protein 
393 
levels in the lungs of AZD7442-TM mAb-treated K18-hACE2 mice at 6 (BA.2) or 7 dpi (all 
394 
other strains) with the indicated SARS-CoV-2 strain (line indicates median; n = 3 naive, n = 8 
395 
for all other groups (Mann-Whitney test with comparison between the isotype control and mAb: 
396 
*, P < 0.05, **, P < 0.01, ***, P < 0.001). 
397 
 
Extended Data Figure 4. Neutralization of SARS-CoV-2 variants by S309-LS and 
398 
S309-GRLR mAbs. Neutralization curves in Vero-TMPRSS2 cells comparing infection of the 
399 
indicated SARS-CoV-2 strain in the presence of each mAb. The average of two experiments 
400 
performed in technical duplicate are shown. For D614G, BA.1, and BA.2 strains, the S309-LS 
401 
neutralization data from Fig. 1f are shown for comparison. 
 
19

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
402 
Extended Data Figure 5. VIR-7831-mediated antibody-dependent cell cytotoxicity 
403 
with NK cells. ExpiCHO-S cells transiently transfected with expression plasmids encoding 
404 
Wuhan D614, BA.1, or BA.2 spike proteins were incubated with the indicated concentrations of 
405 
VIR-7831 or S309-GRLR and mixed with NK cells isolated from healthy donors at a ratio of 1:9 
406 
(target:effector). Target cell lysis was determined by a lactate dehydrogenase release assay. The 
407 
error bars indicate SDs. Each panel is an individual donor. Donors 1 and 3 are heterozygous for 
408 
F158 and V158 FcγRIIIa, whereas donors 2 and 4 are homozygous for V158. 
409 
Extended Data Figure 6. VIR-7831-mediated antibody-dependent cell phagocytosis 
410 
with monocytes. ExpiCHO-S cells transiently transfected with Wuhan-1 D614, BA.1, or BA.2 
411 
spike proteins and fluorescently labelled with PKH67 were incubated with the indicated 
412 
concentrations of VIR-7831 or S309-GRLR mAb and mixed with PBMCs labelled with 
413 
CellTrace Violet from healthy donors carrying different FcγRIIA and IIIA genotypes at a ratio of 
414 
1:20 (target:PBMCs). Association of CD14+ monocytes with spike-expressing target cells 
415 
(ADCP) was determined by flow cytometry. The error bars indicate SD. Each panel is an 
416 
individual donor.  
417 
Extended Data Figure 7. Gating strategy for CD14+ monocytes used for antibody-
418 
dependent cell phagocytosis assays. From PBMCs, monocytes were gated as CD3– CD19– 
419 
CD14+ cells. For ADCP, % FITC+ CellTrace Violet+ CD14+ monocytes were gated as indicated. 
420 
The gate of positive cells was set based on the no mAb control. 
421 
 
422 
SUPPLEMENTAL TABLE TITLES 
423 
Supplementary Table 1. Omicron variant strain mutations as determined by next-
424 
generation sequencing.  
 
20

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
425 
 
 
 
21

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
426 
METHODS 
427 
 Cells. 
Vero-TMPRSS240 and Vero-hACE2-TMPRRS241 cells were cultured at 37°C in 
428 
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum 
429 
(FBS), 10 mM HEPES pH 7.3, 1 mM sodium pyruvate, 1× non-essential amino acids, and 
430 
100 U/ml of penicillin–streptomycin. Vero-TMPRSS2 cells were supplemented with 5 μg/mL 
431 
of blasticidin. Vero-hACE2-TMPRSS2 cells were supplemented with 10 µg/mL of puromycin. 
432 
ExpiCHO-S cells were obtained from Thermo Fisher Scientific. All cells routinely tested 
433 
negative for mycoplasma using a PCR-based assay. 
434 
 
Viruses. The Beta (B.1.351) and Omicron (BA.1 (R346), BA.1.1 (R346K), and BA.2) 
435 
strains were obtained from nasopharyngeal isolates. All virus stocks were generated in Vero-
436 
TMPRSS2 cells and subjected to next-generation sequencing as described previously41 to 
437 
confirm the presence and stability of expected substitutions (see Supplementary Table 1). All 
438 
virus experiments were performed in an approved biosafety level 3 (BSL-3) facility.  
439 
 
Monoclonal antibody purification. The mAbs studied in this paper, S309, AZD8895, 
440 
AZD1061, and the AZD7442 cocktail have been described previously4,11,18.  
441 
S309-LS and S309-GRLR were produced in ExpiCHO-S cells and affinity-purified using 
442 
HiTrap Protein A columns (GE Healthcare, HiTrap mAb select Xtra #28-4082-61) followed by 
443 
buffer exchange to histidine buffer (20 mM histidine, 8% sucrose, pH 6.0) using HiPrep 26/10 
444 
desalting columns. The final products were sterilized after passage through 0.22 μm filters and 
445 
stored at 4°C. VIR-7831 (clinical lead variant of S309-LS) was produced at WuXi Biologics. 
446 
AZD8895 and AZD1061 mAbs were cloned into mammalian expression vectors and 
447 
expressed as IgG1 constructs with the TM (L234F/L235E/P331S) Fc modification with or 
448 
without a second YTE (M252Y/S254T/T256E) modification to extend half-life in humans. 
 
22

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
449 
MAbs were expressed in 293F cells after transfection with 293fectin (Thermo Fisher Scientific) 
450 
and isolated from supernatants by affinity chromatography using Protein A or Protein G columns 
451 
(GE Healthcare). MAbs were eluted with 0.1 M glycine at low pH and dialyzed into PBS. 
452 
Mouse experiments. Animal studies were carried out in accordance with the 
453 
recommendations in the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National 
454 
Institutes of Health. The protocols were approved by the Institutional Animal Care and Use 
455 
Committee at the Washington University School of Medicine (assurance number A3381–01). 
456 
Virus inoculations were performed under anesthesia that was induced and maintained with 
457 
ketamine hydrochloride and xylazine, and all efforts were made to minimize animal suffering. 
458 
Heterozygous K18-hACE2 C57BL/6J mice (strain: 2B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J) 
459 
and wild-type C57BL/6J (strain: 000664) mice were obtained from The Jackson Laboratory. 
Human FcγR transgenic mice20 (FcγRα-/-
460 
461 
/hFcγRI+/hFcγRIIAR131+/hFcγRIIB+/hFcγRIIIAF158+/hFcγRIIIB+) were a generous gift (J. 
462 
Ravetch, Rockefeller University) and bred at Washington University. All animals were housed in 
463 
groups and fed standard chow diets. For experiments with K18-hACE2 mice, eight- to ten-week-
464 
old female mice were administered the indicated doses of the respective SARS-CoV-2 strains 
465 
(see Figure legends) by intranasal administration. For hFcγR mouse experiments, 12-week-old 
466 
male mice were administered 105 FFU of a Beta (B.1.351) isolate by intranasal administration. In 
467 
vivo studies were not blinded, and mice were randomly assigned to treatment groups. No sample-
468 
size calculations were performed to power each study. Instead, sample sizes were determined 
469 
based on prior in vivo virus challenge experiments. Mice were administered the indicated mAb 
470 
dose by intraperitoneal injection one day before intranasal inoculation with the indicated SARS-
 
23

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
471 
CoV-2 strain. AZD7442-TM (lacking the YTE modification that accelerates antibody 
472 
elimination in rodents) was used in mouse studies.   
473 
Focus reduction neutralization test. Serial dilutions of mAbs were incubated with 102 
474 
focus-forming units (FFU) of different strains or variants of SARS-CoV-2 for 1 h at 37°C. 
475 
Antibody-virus complexes were added to Vero-TMPRSS2 cell monolayers in 96-well plates and 
476 
incubated at 37°C for 1 h. Subsequently, cells were overlaid with 1% (w/v) methylcellulose in 
477 
MEM. Plates were harvested 48-72 h later by removing overlays and fixing with 4% PFA in PBS 
478 
for 20 min at room temperature. Plates were washed and incubated with an oligoclonal pool of 
479 
SARS2-2, SARS2-11, SARS2-16, SARS2-31, SARS2-38, SARS2-57, and SARS2-7142. Plates 
480 
with Omicron variant strains were additionally incubated  with CR3022 and a pool of anti-
481 
SARS-CoV-2 mAbs that cross-react with SARS-CoV43. Subsequently, samples were incubated 
482 
with HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (Sigma, 12-349) and HRP-conjugated goat anti-
483 
human IgG (Sigma, A6029) in PBS supplemented with 0.1% saponin and 0.1% bovine serum 
484 
albumin. SARS-CoV-2-infected cell foci were visualized using TrueBlue peroxidase substrate 
485 
(KPL) and quantitated on an ImmunoSpot microanalyzer (Cellular Technologies).  
486 
Measurement of viral RNA levels. Tissues were weighed and homogenized with 
487 
zirconia beads in a MagNA Lyser instrument (Roche Life Science) in 1 mL of DMEM medium 
488 
supplemented with 2% heat-inactivated FBS. Tissue homogenates were clarified by 
489 
centrifugation at 10,000 rpm for 5 min and stored at −80°C. RNA was extracted using the 
490 
MagMax mirVana Total RNA isolation kit (Thermo Fisher Scientific) on the Kingfisher Flex 
491 
extraction robot (Thermo Fisher Scientific). RNA was reverse transcribed and amplified using 
492 
the TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit (Thermo Fisher Scientific). Reverse transcription was 
493 
carried out at 48°C for 15 min followed by 2 min at 95°C. Amplification was accomplished over 
 
24

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
494 
50 cycles as follows: 95°C for 15 s and 60°C for 1 min. Copies of SARS-CoV-2 N gene RNA in 
495 
samples were determined using a previously published assay44. Briefly, a TaqMan assay was 
496 
designed to target a highly conserved region of the N gene (Forward primer: 
497 
ATGCTGCAATCGTGCTACAA; Reverse primer: GACTGCCGCCTCTGCTC; Probe: /56-
498 
FAM/TCAAGGAAC/ZEN/AACATTGCCAA/3IABkFQ/). This region was included in an RNA 
499 
standard to allow for copy number determination down to 10 copies per reaction. The reaction 
500 
mixture contained final concentrations of primers and probe of 500 and 100 nM, respectively. 
501 
 
Viral plaque assay.  Vero-TMPRSS2-hACE2  cells  were  seeded  at  a  density  of  1×105 
502 
cells per well in 24-well tissue culture plates. The following day, medium was removed and 
503 
replaced with 200 μL of material to be titrated diluted serially in DMEM supplemented with 2% 
504 
FBS. One hour later, 1 mL of methylcellulose overlay was added. Plates were incubated for 72 h, 
505 
then fixed with 4% paraformaldehyde (final concentration) in PBS for 20 min. Plates were 
506 
stained with 0.05% (w/v) crystal violet in 20% methanol and washed twice with distilled, 
507 
deionized water. 
508 
Transient expression of recombinant SARS-CoV-2 protein and flow cytometry. 
509 
ExpiCHO-S cells were seeded at 6 x 106 cells/mL in a volume of 5 mL in a 50 mL bioreactor. 
510 
The following day, cells were transfected with SARS-CoV-2 spike glycoprotein-encoding 
511 
pcDNA3.1(+) plasmids (BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019, accession number MN908947, Wuhan 
512 
D614; Omicron BA.1 and BA.2 generated by overlap PCR mutagenesis of the Wuhan D614 
513 
plasmid) harboring the Δ19 C-terminal truncation26. Spike encoding plasmids were diluted in 
514 
cold OptiPRO SFM (Life Technologies, 12309-050), mixed with ExpiFectamine CHO Reagent 
515 
(Life Technologies, A29130) and added to cells. Transfected cells were then incubated at 37˚C 
516 
with 8% CO2 with an orbital shaking speed of 250 RPM (orbital diameter of 25 mm) for 24 to 48 
 
25

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
517 
h. Transiently transfected ExpiCHO-S cells were harvested and washed twice in wash buffer 
518 
(PBS 2% FBS, 2 mM EDTA). Cells were counted and distributed into round bottom 96-well 
519 
plates (Corning, 3799) and incubated with serial dilutions of mAb starting at 10 μg/mL. Alexa 
520 
Fluor647-labelled Goat Anti-human IgG secondary Ab (Jackson Immunoresearch, 109-606-098) 
521 
was prepared at 2 μg/mL and added onto cells after two washing steps. Cells were then washed 
522 
twice and resuspended in wash buffer for data acquisition at ZE5 cytometer (BioRad). 
523 
Fc-mediated effector functions. Primary cells were collected from healthy human 
524 
donors with informed consent and authorization via the Comitato Etico Canton Ticino 
525 
(Switzerland). ADCC assays were performed using ExpiCHO-S cells transiently transfected with 
526 
SARS-CoV-2 spike glycoproteins (Wuhan D614, BA.1 or BA.2) as targets. NK cells were 
527 
isolated from fresh blood of healthy donors using the MACSxpress NK Isolation Kit (Miltenyi 
528 
Biotec, cat. no. 130-098-185). Target cells were incubated with titrated concentrations of mAbs 
529 
for 10 min and then with primary human NK cells at an effector:target ratio of 9:1. ADCC was 
530 
measured using LDH release assay (Cytotoxicity Detection Kit (LDH) (Roche; cat. no. 
531 
11644793001) after 4 h incubation at 37˚C.  
532 
ADCP assays were performed using ExpiCHO-S cells transiently transfected with SARS-
533 
CoV-2 spike glycoproteins (Wuhan D614, BA.1, or BA.2) and labelled with PKH67 (Sigma 
534 
Aldrich) as targets. PMBCs from healthy donors were labelled with CellTrace Violet 
535 
(Invitrogen) and used as source of phagocytic effector cells. Target cells (10,00 per well) were 
536 
incubated with titrated concentrations of mAbs for 10 min and then mixed with PBMCs (200,000 
537 
per well). The next day, cells were stained with APC-labelled anti-CD14 mAb (BD Pharmingen), 
538 
BV605-labelled anti-CD16 mAb (Biolegend), BV711-labelled anti-CD19 mAb (Biolegend), 
539 
PerCP/Cy5.5-labelled anti-CD3 mAb (Biolegend), APC/Cy7-labelled anti-CD56 mAb 
 
26

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
540 
(Biolegend) for the identification of CD14+ monocytes. After 20 min, cells were washed and 
541 
fixed with 4% paraformaldehyde before acquisition on a ZE5 Cell Analyzer (Biorad). Data were 
542 
analyzed using FlowJo software. The % ADCP was calculated as % of monocytes (CD3- CD19- 
543 
CD14+ cells) positive for PKH67.  
544 
Data availability. All data supporting the findings of this study are available within the 
545 
paper and are available from the corresponding author upon request. 
546 
Statistical analysis. All statistical tests were performed as described in the indicated 
547 
figure legends using Prism 8.0. Statistical significance was determined using a one-way ANOVA 
548 
when comparing three or more groups. When comparing two groups, a Mann-Whitney test was 
549 
performed. The number of independent experiments performed are indicated in the relevant 
550 
figure legends. For correlation analyses, best-fit lines were calculated using a simple linear 
551 
regression. Two-tailed Pearson correlation was used to calculate the R2 and P values indicated 
552 
within each panel. 
553 
 
 
 
27

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
554 
REFERENCES 
555 
 
556 
1 VanBlargan, 
L. 
A. et al. An infectious SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron virus escapes 
557 
neutralization by therapeutic monoclonal antibodies. Nat Med, doi:10.1038/s41591-021-
558 
01678-y (2022). 
559 
2 Liu, 
L. et al. Striking antibody evasion manifested by the Omicron variant of SARS-
560 
CoV-2. Nature, doi:10.1038/s41586-021-04388-0 (2021). 
561 
3 McCallum, 
M. et al. Structural basis of SARS-CoV-2 Omicron immune evasion and 
562 
receptor engagement. Science 375, 864-868, doi:10.1126/science.abn8652 (2022). 
563 
4 Cameroni, 
E. et al. Broadly neutralizing antibodies overcome SARS-CoV-2 Omicron 
564 
antigenic shift. Nature 602, 664-670, doi:10.1038/s41586-021-04386-2 (2022). 
565 
5 Iketani, 
S. et al. Antibody Evasion Properties of SARS-CoV-2 Omicron Sublineages. 
566 
bioRxiv, doi:10.1101/2022.02.07.479306 (2022). 
567 
6 Dejnirattisai, 
W. et al. SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 leads to widespread escape from 
568 
neutralizing antibody responses. Cell 185, 467-484 e415, doi:10.1016/j.cell.2021.12.046 
569 
(2022). 
570 

DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C. & Ravetch, J. V. Broadly neutralizing anti-
571 
influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection. J Clin Invest 
572 
126, 605-610, doi:10.1172/jci84428 (2016). 
573 

DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P. & Ravetch, J. V. Broadly neutralizing hemagglutinin 
574 
stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus 
575 
in vivo. Nat Med 20, 143-151, doi:10.1038/nm.3443 (2014). 
576 

Gunn, B. M. et al. A Role for Fc Function in Therapeutic Monoclonal Antibody-
577 
Mediated Protection against Ebola Virus. Cell Host Microbe  24, 221-233.e225, 
578 
doi:10.1016/j.chom.2018.07.009 (2018). 
579 
10 
Saphire, E. O. et al. Systematic Analysis of Monoclonal Antibodies against Ebola Virus 
580 
GP Defines Features that Contribute to Protection. Cell  174, 938-952.e913, 
581 
doi:10.1016/j.cell.2018.07.033 (2018). 
582 
11 Pinto, 
D. et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV 
583 
antibody. Nature 583, 290-295, doi:10.1038/s41586-020-2349-y (2020). 
584 
12 
Zost, S. J. et al. Potently neutralizing and protective human antibodies against SARS-
585 
CoV-2. Nature 584, 443-449, doi:10.1038/s41586-020-2548-6 (2020). 
586 
13 
Saunders, K. O. Conceptual Approaches to Modulating Antibody Effector Functions and 
587 
Circulation Half-Life. Frontiers in Immunology  10, doi:10.3389/fimmu.2019.01296 
588 
(2019). 
589 
14 
Acqua, W. F. D. et al. Increasing the Affinity of a Human IgG1 for the Neonatal Fc 
590 
Receptor: Biological Consequences. The Journal of Immunology  169, 5171, 
591 
doi:10.4049/jimmunol.169.9.5171 (2002). 
592 
15 
Halfmann, P. J. et al. SARS-CoV-2 Omicron virus causes attenuated disease in mice and 
593 
hamsters. Nature, doi:10.1038/s41586-022-04441-6 (2022). 
594 
16 
Halfmann, P. J. et al. SARS-CoV-2 Omicron virus causes attenuated disease in mice and 
595 
hamsters. Nature, doi:10.1038/s41586-022-04441-6 (2022). 
596 
17 Dong, 
J. et al. Genetic and structural basis for SARS-CoV-2 variant neutralization by a 
597 
two-antibody cocktail. Nat Microbiol  6, 1233-1244, doi:10.1038/s41564-021-00972-2 
598 
(2021). 
 
28

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
599 
18 
Loo, Y. M. et al. The SARS-CoV-2 monoclonal antibody combination, AZD7442, is 
600 
protective in non-human primates and has an extended half-life in humans. Sci Transl 
601 
Med, eabl8124, doi:10.1126/scitranslmed.abl8124 (2022). 
602 
19 
Oganesyan, V., Gao, C., Shirinian, L., Wu, H. & Dall'Acqua, W. F. Structural 
603 
characterization of a human Fc fragment engineered for lack of effector functions. Acta 
604 
Crystallogr D Biol Crystallogr 64, 700-704, doi:10.1107/S0907444908007877 (2008). 
605 
20 
Smith, P., DiLillo, D. J., Bournazos, S., Li, F. & Ravetch, J. V. Mouse model 
606 
recapitulating human Fcγ receptor structural and functional diversity. Proc Natl Acad Sci 
607 
U S A 109, 6181-6186, doi:10.1073/pnas.1203954109 (2012). 
608 
21 Tatham, 
L. et al. Lack of Ronapreve (REGN-CoV; casirivimab and imdevimab) 
609 
virological efficacy against the SARS-CoV-2 Omicron variant (B.1.1.529) in K18-
610 
hACE2 mice. bioRxiv, doi:10.1101/2022.01.23.477397 (2022). 
611 
22 Westendorf, 
K. et al. LY-CoV1404 (bebtelovimab) potently neutralizes SARS-CoV-2 
612 
variants. bioRxiv, doi:10.1101/2021.04.30.442182 (2021). 
613 
23 
Chen, R. E. et al. In vivo monoclonal antibody efficacy against SARS-CoV-2 variant 
614 
strains. Nature 596, 103-108, doi:10.1038/s41586-021-03720-y (2021). 
615 
24 
Cobb, R. R. et al. A combination of two human neutralizing antibodies prevents SARS-
616 
CoV-2 infection in cynomolgus macaques. Med (N Y), doi:10.1016/j.medj.2022.01.004 
617 
(2022). 
618 
25 Beaudoin-Bussières, 
G. et al. A Fc-enhanced NTD-binding non-neutralizing antibody 
619 
delays virus spread and synergizes with a nAb to protect mice from lethal SARS-CoV-2 
620 
infection. Cell Rep 38, 110368, doi:10.1016/j.celrep.2022.110368 (2022). 
621 
26 Ou, 
X. et al. Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and 
622 
its immune cross-reactivity with SARS-CoV. Nature Communications  11, 1620, 
623 
doi:10.1038/s41467-020-15562-9 (2020). 
624 
27 Schäfer, 
A. et al. Antibody potency, effector function, and combinations in protection 
625 
and therapy for SARS-CoV-2 infection in vivo. J Exp Med 
218
626 
doi:10.1084/jem.20201993 (2021). 
627 
28 Ullah, 
I. et al. Live imaging of SARS-CoV-2 infection in mice reveals that neutralizing 
628 
antibodies require Fc function for optimal efficacy. Immunity  54, 2143-2158.e2115, 
629 
doi:10.1016/j.immuni.2021.08.015 (2021). 
630 
29 Yamin, 
R. et al. Fc-engineered antibody therapeutics with improved anti-SARS-CoV-2 
631 
efficacy. Nature 599, 465-470, doi:10.1038/s41586-021-04017-w (2021). 
632 
30 
Grunst, M. W. & Uchil, P. D. Fc effector cross-reactivity: A hidden arsenal against 
633 
SARS-CoV-2's evasive maneuvering. Cell Rep Med 
3, 100540, 
634 
doi:10.1016/j.xcrm.2022.100540 (2022). 
635 
31 Richardson, 
S. 
I. et al. SARS-CoV-2 Beta and Delta variants trigger Fc effector function 
636 
with increased cross-reactivity. Cell Rep Med 
3, 100510, 
637 
doi:10.1016/j.xcrm.2022.100510 (2022). 
638 
32 
Pierson, T. C. & Diamond, M. S. A game of numbers: the stoichiometry of antibody-
639 
mediated neutralization of flavivirus infection. Prog Mol Biol Transl Sci  129, 141-166, 
640 
doi:10.1016/bs.pmbts.2014.10.005 (2015). 
641 
33 Kawaoka, 
Y. et al. Characterization and antiviral susceptibility of SARS-CoV-2 
642 
Omicron/BA.2. Res Sq, doi:10.21203/rs.3.rs-1375091/v1 (2022). 
 
29

https://doi.org/10.1101/2022.03.17.484787
doi: 
bioRxiv preprint 
this version posted March 18, 2022. 

The copyright holder for this preprint
(which was not certified by peer review) is the author/funder, who has granted bioRxiv a license to display the preprint in perpetuity. It is made 
CC-BY-NC-ND 4.0 International license
available under a
.
643 
34 
Bentley, E. G. et al. SARS-CoV-2 Omicron-B. 1.1. 529 Variant leads to less severe 
644 
disease than Pango B and Delta variants strains in a mouse model of severe COVID-19. 
645 
bioRxiv (2021). 
646 
35 Abdelnabi, 
R. et al. The omicron (B. 1.1. 529) SARS-CoV-2 variant of concern does not 
647 
readily infect Syrian hamsters. Antiviral Research, 105253 (2022). 
648 
36 
Lempp, F. A. et al. Lectins enhance SARS-CoV-2 infection and influence neutralizing 
649 
antibodies. Nature 598, 342-347, doi:10.1038/s41586-021-03925-1 (2021). 
650 
37 Suryadevara, 
N. et al. Neutralizing and protective human monoclonal antibodies 
651 
recognizing the N-terminal domain of the SARS-CoV-2 spike protein. Cell  184, 2316-
652 
2331.e2315, doi:10.1016/j.cell.2021.03.029 (2021). 
653 
38 Lan, 
J. et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the 
654 
ACE2 receptor. Nature 581, 215-220, doi:10.1038/s41586-020-2180-5 (2020). 
655 
39 
Goddard, T. D. et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and 
656 
analysis. Protein Science 27, 14-25, doi:10.1002/pro.3235 (2018). 
657 
40 Zang, 
R. et al. TMPRSS2 and TMPRSS4 promote SARS-CoV-2 infection of human 
658 
small intestinal enterocytes. Sci Immunol 5, doi:10.1126/sciimmunol.abc3582 (2020). 
659 
41 
Chen, R. E. et al. Resistance of SARS-CoV-2 variants to neutralization by monoclonal 
660 
and serum-derived polyclonal antibodies. Nat Med, doi:10.1038/s41591-021-01294-w 
661 
(2021). 
662 
42 Liu, 
Z. et al. Identification of SARS-CoV-2 spike mutations that attenuate monoclonal 
663 
and serum antibody neutralization. Cell Host Microbe  29, 477-488.e474, 
664 
doi:10.1016/j.chom.2021.01.014 (2021). 
665 
43 VanBlargan, 
L. 
A. et al. A potently neutralizing SARS-CoV-2 antibody inhibits variants 
666 
of concern by utilizing unique binding residues in a highly conserved epitope. Immunity 
667 
54, 2399-2416.e2396, doi:10.1016/j.immuni.2021.08.016 (2021). 
668 
44 
Case, J. B., Bailey, A. L., Kim, A. S., Chen, R. E. & Diamond, M. S. Growth, detection, 
669 
quantification, and inactivation of SARS-CoV-2. Virology 
548, 39-48, 
670 
doi:10.1016/j.virol.2020.05.015 (2020). 
671 
 
672 
 
 
30